此前在美国和加拿大胚胎移植协会的联席会议上，有一个关于牛胚胎分级的会前研讨会，与会者就如何对不同阶段和质量的胚胎进行分级进行了探讨，其中体外生产（IVP）和体内生产（IVD）胚胎之间的差异引发了大家更多关注。在这里，我们将回顾IVP和IVD胚胎分级所涉及的一些挑战，并提出一种方法，以便于让研究人员和从业者在此基础上合作收集并轻松共享数据，为IVP胚胎分级提供最佳指南。
真正验证胚胎质量的办法是将其转移给受体，看看是否有健康的后代产生。但移植每个胚胎是不切实际的，这就给从业者留下了一项艰巨的任务，即仅凭观察就能确定胚胎是否能受孕。虽然大多数从业者依托国际胚胎移植协会（IETS手册，第4版）制定的标准便可以更好地给体内产生的胚胎分级，并已经注意到IVP胚胎与IVD胚胎存在差异，如从线粒体功能和代谢到发育速率和基因表达的差异等。这里不再赘述。此次我们将专注于IVD和IVP胚胎之间的可观察到的差异。因为大多数从业者和胚胎学家在看到一个好的胚胎时都知道是一个好的胚胎，但是当涉及到中等质量的胚胎（2级和3级）时，它们就很难区分了。许多人认为IVP胚胎具有更多可变的形态，因此更难分级。其实，可以根据胚胎是否符合一些物理特征进行分级，包括形状，细胞质的颜色/密度，细胞的数量和致密性，卵周隙面积，挤压或退化细胞的数量，细胞质囊泡的频率和大小以及相对于年龄的发育阶段等。以下是一些最显著的差异。
·卵周隙和压实性
几项研究已经证明了IVP和IVD胚胎在卵周隙大小方面的差异，这通常与胚胎在桑葚胚形成过程中的压实程度有关。在Van Soom和de Kruif(1992)的一项研究中，将IVD的受精卵和2细胞胚胎与屠宰场产生的IVP的受精卵在相同的系统中培养，可以观察到体外受精胚胎桑葚胚期的卵周隙缩小了。此外，IVP受精卵时期的卵周隙在体外胚胎整个发育过程中是最大的。尽管自记录以来已进行了24年的研究，这一特征目前在IVP胚胎中仍然可见(图1)。
图1 处于桑葚发育阶段的IVP（A和C）和IVD（B和D）牛胚胎。注意IVP胚胎的卵黄周围间隙较小，压实性差。胚胎C的左上边缘也有一些挤压的物质。IVD胚胎的卵周隙较均匀，桑葚胚的压实度也比较均匀。
碎片细胞和挤压细胞
许多从业者和胚胎学家已经注意到与IVP胚胎相关的细胞碎片的数量和频率有增加。这已在IVP和IVD胚胎的超微结构分析中得到证实。Rizos及其同事（2002）在胚胎的卵周隙中发现了细胞碎片，并在囊胚腔的内细胞团周围发现了细胞碎片。这可能使IVP胚胎分级特别困难，特别是在囊胚阶段，当碎片被压缩在透明带和扩张的胚胎之间，导致其数量可能难以评估。
国际胚胎移植协会胚胎分级指南规定，透明带内可活胚胎的细胞质量超过85%为1级胚胎(最高质量)， 2级50%，3级25%，4级<25%。能够有效地评估胚胎中活细胞的数量对于为胚胎分级是至关重要的。图2和图3提供了IVP和IVD胚胎在不同发育阶段具有不同数量碎片的例子。
图2 两个IVP胚胎(A和B)和一个IVD胚胎(C)具有不同数量的挤压细胞或碎片。A是一种桑葚胚，其细胞碎片数量最少，因此按照该标准可以被归类为1级胚胎，但压实性差和卵周隙极小将使该胚胎降至2级。B组是早期IVP囊胚，有大量碎片，可以将其归入2级类别。图C是第7天IVD胚胎，具有可接受的碎片量，因此它仍被视为1-或高级2+。
图3 如果在相当低的功率下扫描这组胚胎，人们可能很快就会认为A图中黄色箭头所示的胚胎是1级胚胎。在高倍镜下，人们可以更容易地看到挤压在透明带上的挤压细胞，这可能被误认为是内细胞团块。这是一个很容易犯的错误，如果分级时没有在适当的放大倍率下观察胚胎(至少60倍)。无组织或内细胞团形成不良是IVP胚胎的另一个常见特征。图C为内细胞团明确的IVP胚胎。
·液泡
一些胚胎的细胞中似乎有气泡或液泡，这可能使它们呈现颗粒状外观。这发生在IVP和IVD胚胎中，尽管IVP胚胎的发生率似乎更高。IVP的胚胎在卵裂球的细胞质内表现出比IVD的胚胎更多的空泡化，液泡化的大小和丰度差异很大（图4）。液泡化的原因尚不清楚，但通常与胚胎质量差有关。
图4 两个广泛液泡化的IVP胚胎。左图有一个6细胞胚胎有各种大小的液泡。右面有一个囊胚，在滋养层和内细胞团细胞中可以看到许多非常小的液泡。
·细胞形状、不透明度和脂质
IVP和IVD胚胎的超微结构分析也揭示了与脂质含量有关的差异。并对来自超排卵奶牛的桑葚胚与来自屠宰场卵巢的桑葚胚进行了比较。IVP胚胎的脂质体积密度高于IVD胚胎。在整个培养过程中，10%血清培养的IVP胚胎在前72 h的脂质体积密度高于限制血清培养系统、无血清培养系统或体内产生的胚胎。其他研究小组也注意到IVP胚胎中脂滴的发生率高于IVD胚胎，证实了其他研究中注意到的情况，并与胚胎低温耐受性差有关。较高的脂质含量可以使胚胎看起来更黑，细胞更不透明。和液泡一样，胚胎也会呈颗粒状。Van Soom和de Kruif(1992)指出，与IVD胚胎不同，IVP胚胎有更多方形、肿胀的卵裂球和囊胚中不规则、不透明的细胞。
形态差异的含义
鉴于这些形态差异，IVP胚胎真的更难分级吗？1995年，Farin及其同事试图通过一项研究来解决这个问题，其中六名经验丰富的胚胎学家被要求对相同的IVP和IVD胚胎进行分级。他们发现，在胚胎发育阶段，技术人员对IVD胚胎分级的一致性(85%)高于IVP胚胎的(72%)。区分IVP胚胎的桑葚胚和囊胚更具挑战性。就质量而言，IVD(61%)和IVP胚胎(58%)的一致性相似，其中最具挑战性的是2级和3级IVP胚胎之间的分化。很可能是胚胎质量不好，过多的碎片和挤压细胞以及胚胎的不透明导致了评估者之间的差异。
结语
很明显，IVP胚胎的形态与IVD胚胎不同。随着IVP胚胎越来越多地融入到牛的繁殖实践中，了解各种形态如何影响妊娠率，对于帮助从业者做出与IVD胚胎相当（或更好）的妊娠率至关重要。我们现在有技术来生成必要的数据，为有关胚胎分级的问题提供近乎实时的反馈，为新手和有经验的胚胎学家提供有价值的培训工具，以及信息数据库，使我们能够更好地了解IVP胚胎（包括具有上述形态的胚胎），并使IVP胚胎在全球范围内的行业中发挥更大作用
来源：
JenniferBarfield,Ph.D.Evaluation of in vitro-produced bovine embryos: Session:IVPvsIVD Embryo Evaluation[C].2441 Village Green Place Champaign,IL 61822 :American Embryo Transfer Association
编译：可心
