前言

胚胎生产技术能通过减少世代间隔和提高选择强度来促进遗传发育，现已成功在牛繁殖领域进行商业应用，理论上最有效的方法是利用最好的供体牛生产大量的体外胚，进行活检和冷冻并进行遗传评估，然后将最令人满意的基因型转移给受体。在实际生产应用中，除了鲜胚移植还会涉及胚胎冷冻保存等环节，以便随时随地应用。但在移植冷冻胚胎后平均妊娠率往往会稍低于鲜胚移植时的平均妊娠率，进而导致一些优质胚胎的浪费。本研究的目的旨在评估在慢速冷冻前后同一供体荷斯坦母牛体内或体外生产的胚胎脂质组成及变化，进而为通过调节脂质成分提高胚胎对冷冻的耐受能力提供参考。

结果：

胚胎生产资料：通过OPU-IVF进行5次体外胚胎生产，通过冲洗子宫角进行3次体内胚胎收集，以产生研究所需的胚胎。用IVF和冲胚采集程序分别产生了95枚和78枚（Q1级)扩张囊胚（见表1A、B）。IVF过程中每个供体在体外产生的Q1囊胚的平均数量为2.1±0.3，体内胚胎期间每个供体为3.4±1.0。

牛胚胎的脂质组成: 使用超高压液相色谱 (UHPLC) 获得了87个Q1扩张囊胚的液相色谱高分辨率质谱(LC-HRMS)光谱，并确定了1686个特征。检查数据后，在质量控制(QC)和同位素消除中消除变异系数 (CV)优于30%的离子，保留了496个特征。在这496个特征中，74个是使用SimLipid数据库注释的，注释的脂质主要是甘油三酯 (32/74)，甘油二酯 (12/74)，甘油磷脂和溶血磷脂 (12/74)（补充表S1）。这87个Q1级囊胚中，43个由IVF获得，44个由冲胚收集得。43个体外胚中提取了22个鲜胚的脂质（13个雄性和9个雌性胚胎），21个胚胎（8个雄性和13个雌性胚胎）先冷冻后再进行脂质提取。对于44个体外胚，提取了22个鲜胚的脂质（11个雄性和11个雌性胚胎），剩下22个胚胎（10个雄性和12个雌性胚胎）冷冻后进行脂质提取（图1）。

实验设计：八头荷斯坦青年母牛通过OPU-IVF和体内胚胎收集程序生产体外和体内胚胎。受精7天后，对所有1级扩张囊胚进行活检和性别鉴定。每组一半在新鲜状态下进行脂质提取，另一半在进行脂质提取之前先冷冻。脂质提取物通过液相色谱-高分辨质谱分析并允许检测496个特征。

体内或体外产生的鲜胚中的脂质质谱特征：为评估胚胎来源对其脂质谱的影响，使用了44个囊胚，包括22个体外胚和22个体内胚（图1）。主成分分析(PCA)显示体内（橙色点）和体外（蓝色点）胚胎之间存在分离（图2A）。正交偏最小二乘分析(O-PLS-DA)显示了体内（橙色点）和体外（蓝色点）产生的胚胎之间的两种不同特征的明显区分，交叉验证的预测能力(Q2)为0.88，并且该模型由CV-Anova评估具有良好的可靠性，p值<0.0001（图2B）。拟合模型包括314个特征，这意味着大多数已识别特征（314/496）参与解释体内和体外产生的胚胎之间的脂质特征差异（补充表S2）。单变量分析突出了体内和体外对应物之间的105个显着不同的特征（p<0.05和倍数变化<0.66或>1.5），包括50种注释脂质（补充表S1）。在105个显着特征中，27个的倍数变化大于2，表明体外产生的胚胎丰度增加，12个特征的倍数变化小于0.5，表明体外产生的胚胎丰度降低（表2）。在这105个显着特征中，有10个在拟合模型中没有发现，包括5种注释脂质、2种脂肪酰胺、胡椒素和N-油酰GABA、1种氧化甘油磷脂、OHOHA-PC和2种三酰甘油、TG(16:0/16:1/16:1)和TG(46:0)。基于倍数变化和p值的火山图突出了体外产生的胚胎的一般脂质富集，特别是在甘油三酯(TG)和氧化甘油磷脂(OHHdia-PS)中表现出大于40的倍数变化（图2C）。相反，体内产生的胚胎富含甘油磷脂，特别是磷脂酰乙醇胺(PE)、丝氨酸 (PS)、甘油(PG)和肌醇(PI)。

图2如下，(A)主成分分析图(PCA)，代表根据主成分分析的体内和体外胚胎之间的差异。橙色点显示体内来源胚胎的数据，蓝色点显示体外来源胚胎的数据。(B)通过正交偏最小二乘判别分析(O-PLS-DA)进行多变量分析，根据胚胎的脂质分布区分胚胎起源（体内与体外）。(C)基于倍数变化和p值的火山图单变量分析，突出显示几种脂质。蓝色和橙色点对应体外和体内产生的胚胎之间显着不同的脂质。灰色点代表不重要的点。粉红色圆点对应于具有显著p值但倍数变化在0.66和1.5之间的脂质。该区域右侧的所有脂质在体外胚胎都过多（蓝点），而该区域左侧的脂类在体内胚中过多（橙色点）。在p<0.05和倍数变化大于1.5或小于0.66时确定统计显著性。显着不同的注释脂质在火山图中由以下缩写表示，磷脂酰乙醇胺 (PE)、肌醇 (PI)、丝氨酸 (PS)、甘油 (PG)、甘油三酯 (TG) 和氧化甘油磷脂 (OHHdia-PS 和 PKHdiA -PS）。

在该表中，在FC>1.5或<0.66的105种不同脂质中，仅显示了39种最不同的脂质，此处显示了具有FDR（错误发现率）的p值。补充表S1中提供了包含所有重要特征和脂质注释的完整表格。

在慢速冷冻前后体内胚的脂质质谱特征：为了分析慢速冷冻过程对体内胚脂质谱的影响，使用了44个囊胚，分为两组，一半的体内胚进行慢速冷冻。PCA显示出区分体内新鲜（红）和冷冻（绿）胚胎的趋势（图 3A）。多变量分析 (O-PLS-DA) 显示新鲜和冷冻体内胚之间的两种不同特征的明显区分，交叉验证的预测能力(Q2)为0.82，该模型由CV-Anova评估具有良好的可靠性，p值<0.0001（图3B）。拟合模型包括162个参与解释新鲜体内胚和冷冻胚之间脂质分布差异的特征（补充表 S2）。单变量分析突出了新鲜和冷冻体内产生的胚胎之间显着不同的35个特征（p<0.05，FC<0.66或>1.5）（表3），包括20种注释脂质（补充表S1）。在35个显著特征中，19个表现出> 1.5的倍数变化，表明与新鲜胚胎相比，冷冻体内胚的丰度增加，和16个特征表现出的倍数变化< 0.66，表明与新鲜胚胎相比，冷冻体内胚的丰度降低（表3）。35个显着特征中，有两种未被发现，包括一种类二十烷酸、乙基-二乙酰氧基-6E、8E、10E、14Z-二十碳四烯酸酯和一种单酸甘油酯MG(22:5)。

火山图体现了新鲜体内胚中溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 过多，及冷冻胚中两种甘油单酯 (MG) 和一种磷脂酰甘油 (PG) 过多（图3C）。单变量分析还显示LPC组成存在差异，尤其是LPC (18:2)，它仅存在于新鲜胚胎中，因此倍数变化等于0.00（表3）。

慢速冷冻前后体外胚的脂质谱特征：为分析慢速冷冻过程对体外胚脂质质谱的影响，使用了43个囊胚，其中冷冻了21个胚胎。PCA显示体外鲜胚和冷冻胚之间存在重叠（图4A）。多变量分析(O-PLS-DA)显示两个不同的特征，交叉验证的预测能力(Q2)为0.82，并且该模型由CV-Anova评估具有良好的可靠性，p值< 0.0001（图4B）。模型包括47个特征，这些特征参与解释了体外鲜胚和冷冻胚之间的脂质特征差异（补充表S2）。单变量分析突出了新鲜和冷冻体外胚之间显着不同的四种脂质（表4），其中三种注释为LPC（补充表S1）。4个显着特征都具有<0.66 的倍数变化，表明与新鲜胚胎相比，冷冻体外产生的胚胎丰度降低（表4）。火山图表明了新鲜体外胚中LPC过多（图4C）。

讨论：

本文结果表明胚胎脂质谱主要受体外培养方案和慢速冷冻过程的影响，胚胎来源对脂质谱有非常大的影响，这意味着与母体生理环境相比，体外培养条件强烈改变了脂质代谢。实际上与体内胚相比，体外胚富含脂质，尤其是甘油三酯和氧化甘油磷脂。培养基的组成可以改变卵母细胞和胚胎中脂质的含量，尤其是加入血清时。Fergusson和Leese证明，在四细胞阶段牛胚胎的培养基中添加10%的血清会导致甘油三酯水平显著增加。在培养基中添加5%的胎牛血清也可以增加脂质含量，如棕榈酸、棕榈油酸、油酸和硬脂酸。

大量的细胞内脂质会影响冻存过程后胚胎的复苏和存活。减少这些脂质需要相当大的努力。在培养基中添加含有脂质的血清会导致卵母细胞成熟率和囊胚率降低，及凋亡细胞数量的增加。在没有血清的情况下，会使受精卵从1细胞到4细胞的发育周期延长4-5小时，培养过程血清减少会使4细胞期胚胎的持续时间减少从而引发囊胚过早形成。因此，在使用合成血清替代品中可以找到一种解决方案。吩嗪乙基硫酸盐与添加FCS产生的结果相似，同时减少了添加到培养基中的脂滴积累，提高了冷冻保存后的扩张和孵化率。

另一种解决方法是在胚胎培养的最后24小时内去除血清。去除血清刺激脂肪分解，导致游离脂肪酸增加，通过β-氧化消耗能量。添加脂解剂也可以降低细胞内脂质含量的水平。在脂解剂中，肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、毛喉素等通过直接作用于脂解途径的成分来刺激细胞内脂解。与未补充脂解剂的胚胎相比，在玻璃化冷冻前48小时在胚胎的培养基中添加10μM毛喉素诱导脂肪分解，显着提高了妊娠率（18.5%对48.8%）。

脂质过多与冻存效果降低之间的因果关系尚未完全确定。胚胎富含脂质会导致冻存的效果较低，但磷脂似乎对冷冻保存过程很重要。通过提高体外胚的磷脂含量，胚胎质量可能会提高。Banliat 等人已经证明在培养基中以0.05毫克蛋白质/毫升的浓度添加外泌体，培养7天后可使囊胚中的磷脂增加。

体内和体外胚中，鲜胚富含溶血磷脂酰胆碱，而在胚胎冻融后仅有少量的这种脂质。数据表明使用文中慢速冷冻方案，LPCs对冷冻保存高度敏感。LPC的这种高敏感性在人血浆、血清和尿液中没有报道，在几次冷冻(-20℃)/升温循环后它们似乎保持稳定。LPC不仅对慢速冷冻敏感，对玻璃化冷冻也很敏感。事实上，小鼠卵母细胞在玻璃化冷冻后，溶血磷脂含量也降低了。LPC含量的这种降低有助于解释移植后冷冻体外产生的胚胎的存活率、总细胞数和妊娠率的降低。单变量分析并未强调新鲜体内与体外胚中比较这种大量的LPC。尽管如此，体外产生的胚胎的LPC是体内胚胎的1.6倍。这可能是体外培养基造成的，因为血清中含有 LPA。LPA是小分子，通过Lats1/2激酶（大型肿瘤抑制因子1/2）的失活和YAP/TAZ磷酸化的减少来调节Hippo通路，这会诱导它们的核易位，且会通过增加CDX2的表达来促进细胞分化。如果观察到的LPC减少与胚胎质量和存活率下降有关，未来的研究可能会集中在Hippo通路调节上以改善它。

该研究的独创性在于能够优先考虑影响胚胎脂质谱的因素。这样，未来的研究应该集中在培养条件和冷冻方案上，以便它们对胚胎的脂质谱的影响较小。新颖之处还在于对胚胎进行了单独分析，从而能够获得更精确的胚胎脂质谱并突出个体间的变异性。例如，防止溶血磷脂降解的冷冻介质可能有助于改进冷冻方案。但还需要进一步的研究来研究脂质与胚胎质量和冷冻保存敏感性之间的关系。

参考文献： Sarah Janati ldrissi,Daniel Le Bourhis,Antoine Lefevre,Patrick Emond,Laurene Le Berre,Olivier Desnoes,Thierry Joly,Samuel Buff,Virginie Maillard,Laurent Schibler,Pascal Salvetti& Sebastien Elis “Lipid profle of bovine grade-1 blastocysts produced either in vivo or in vitro before and after slow freezing process” scientific reports，(2021)11:11618

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